在与绿魔的战斗之后，蜘蛛侠帕克（托比·马奎尔 Tobey Maguire 饰）无奈地拒绝了自己唯一的爱人玛丽（克尔斯滕·邓斯特 Kirsten Dunst 饰），因为蜘蛛侠的身份会给自己带来麻烦，并且让自己的亲人陷入极大的危险，帕克决定采取行动。 独立承担蜘蛛侠的责任。 帕克一直忙于应对各种挑战：学习超能力的灵活运用； 将自己隐藏在超级英雄和普通大学生的双重身份下，小心翼翼地生活等等，帕克对玛丽越来越难以自拔，但作为蜘蛛侠，他却无法向玛丽敞开心扉。 他的知己哈利一直反对蜘蛛侠，因为他误解了他； 他唯一的亲戚，他的姨妈，也对蜘蛛侠的真实身份心存怀疑。 与此同时，一个新的挑战出现了：邪恶而伟大的章鱼博士。 帕克顶着各种压力肩负起了蜘蛛侠的使命。
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